802.11 Network Structures

 


During this phase, the user registration agent of the end system selects a FA and is a registration request from him. Der dritte, die Authentifizierung zum Speichern von Abrechnungsdaten, zum Gebührenerfassen und zum Aktualisieren von Heimatdomäneninformationen. By continuing without changing your cookie settings, we assume you agree to this.

Early Bird Savings End 1/11!


Within the variable region are hypervariable regions aka complementarity determining regions CDR , which form the antigen binding site. Die übrigen Teile der variablen Regionen werden als Gerüstregionen bezeichnet. The remaining parts of the variable regions are called the framework regions.

Important biological functions, such as receptor binding, activation and enzymatic activity can be assigned, comprising a limited number of amino acid residues often discrete regions of larger protein molecules.

Es wurden auch Peptide entdeckt, die Bindung, Aktivierung oder enzymatische Aktivität zeigen, indem Bibliotheken von Peptiden, die durch die zufällige Verknüpfung von Aminosäureresten erzeugt waren, durchmustert wurden. These peptides can not be a linear array of amino acids in a larger protein molecule that exhibits similar biological activity, and shall be referred to as discontinuous peptide epitopes or mimotopes.

Verschiedene Peptidmimetika wurden beschrieben und kloniert. Various peptide mimetics have been described and cloned. Peptide epitopes and mimotopes are potentially advantageous over large protein molecules due to their small size for use as therapeutic reagents.

Jedoch können die Ergebnisse mit diesen Peptiden als Therapeutika häufig unbefriedigend sein. However, the results can often be unsatisfactory as therapeutics with these peptides.

A disadvantage of the use of peptides as therapeutic reagents is that they are unstable in vivo, in general, that is, their clearance rates from serum may be quite fast. Moreover, it is difficult to predict the therapeutic or other activity of a peptide, when incorporated into a larger molecule since conformational changes and other molecular forces may interfere with the activity of the peptide or entirely eliminate.

Monfardini Christina et al. Attempts have been made to introduce various polypeptides into CDR regions of antibodies. Wie es zuvor erwähnt wurde, kann jedoch die biologische Aktivität von aktiven Polypeptiden aufgrund von Konformationsveränderungen, welche durch umgebende Aminosäuren verursacht werden kann, vermindert oder ausgeräumt werden.

As previously mentioned, however, the biological activity of active polypeptides due to conformational changes which may be caused by surrounding amino acids, can be reduced or eliminated. Daher ist es hierin eine Aufgabe, rational entworfene Antikörper oder Fragmente davon bereitzustellen, die biologisch aktive Peptide umfassen, für die Verwendung als diagnostische und therapeutische Reagenzien.

Therefore, it is an object herein to provide rationally designed antibodies or fragments thereof, include biologically active peptides for use as diagnostic and therapeutic reagents. Hierin werden biologisch aktive rekombinante Antikörper bereitgestellt, welche die Aktivität von biologisch aktiven Peptiden nachahmen, Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper und Verfahren für deren Verwendung in der Therapie und Diagnose.

Herein biologically active recombinant antibodies are provided which mimic the activity of biologically active peptides, methods of making such antibodies and methods for their use in therapy and diagnosis. Diese Antikörper leiden nicht unter einigen der Nachteile von isolierten Peptiden, da Antikörper natürlicherweise lange Serumhalbwertszeiten haben und hinsichtlich der Bindung ihres Ziels hochgradig spezifisch sind. These antibodies do not suffer from some of the disadvantages of isolated peptides, as antibodies naturally have long serum half-lives and are highly specific in binding their target.

It has surprisingly been found that the inclusion of certain amino acids surrounding a target peptide that has been incorporated into an antibody molecule actually increases the biological activity of the peptide. Immunglobuline weisen ein interessierendes Peptid in eine Komplementarität bestimmende Region CDR eines Antikörpermoleküls eingesetzt auf. Immunoglobulins have a peptide of interest in a complementarity determining region CDR of an antibody molecule to used. Das Antikörpermolekül dient als ein Gerüst für die Präsentation des Peptides und verleiht dem Peptid erhöhte Stabilität.

The antibody molecule serves as a scaffold for the presentation of the peptide and confers the peptide enhanced stability. Bio The peptide optionally replaces all the amino acids of a CDR region, or may be added to an existing CDR, whereby the original antigen specificity is destroyed, wherein the CDR region is defined by one of the two accepted schemes see Kabat et al.

Des weiteren können zusätzliche Aminosäuren, welche das Peptid flankieren und die Durchmusterung hinsichtlich optimaler Peptidpräsentation in dem Antikörpergerüst erlauben, in zufälliger Weise eingeführt werden. Furthermore, additional amino acids which flank the peptide and allow the screening of optimum peptide presentation in the antibody framework to be introduced in a random manner.

It has surprisingly been found that in certain cases a proline flanking the peptide which provides an increase in biological activity. In bestimmten Ausführungsformen sind in einem Immunglobulinmolekül Aminosäurereste, die einer die Komplementarität bestimmenden Region CDR entsprechen, durch Aminosäurereste, die ein biologisch aktives thrombopoietisches Peptid umfassen, ersetzt.

In certain embodiments, a complementarity determining region CDR are in an immunoglobulin molecule amino acid residues that correspond to replaced by amino acid residues comprising a biologically active peptide thrombopoietisches.

In einer weiteren bestimmten Ausführungsform sind Aminosäurereste, die wenigstens zwei Komplementarität bestimmenden Regionen CDR entsprechen, jeweils durch Aminosäurereste, die solch ein biologisch aktives Peptid umfassen, ersetzt.

In another particular embodiment, amino acid residues comprising at least two complementarity determining regions CDR correspond, respectively, by amino acid residues comprising such a biologically active peptide replaces. In einem einzelnen Immunglobulinmolekül kann eine oder können mehrere Komplementarität bestimmende Regionen durch ein Peptid ersetzt sein; In a single immunoglobulin molecule, one or more complementarity determining regions have been replaced by a peptide; z. Darüber hinaus könnte man anstelle des Austauschs einer CDR das Peptid zu einer nativen CDR ohne einen tatsächlichen Austausch von Aminosäureresten hinzufügen, während nach wie vor die ursprüngliche Antigenspezifität zerstört wird.

In addition, you could add the peptide to a native CDR without actual replacement of amino acid residues in place of the replacement of a CDR, while still the original antigen specificity is destroyed. Daher wird in einem Aspekt ein biologisch aktives Peptid mit verbesserter Aktivität bereitgestellt, indem man ein Prolin an dessen Carboxyterminus anfügt unter Bildung eines durch Prolin verlängerten biologisch aktiven Peptides, welches dazu verwendet wird, wenigstens einen Teil von wenigstens einer CDR-Region in einem Immunglobulinmolekül zu ersetzen oder an dieses anzufügen.

Therefore, in one aspect, a biologically active peptide with improved activity is provided by appending a proline at its carboxy terminus to form which is used to a prolonged by proline biologically active peptide, at least to a portion of at least one CDR region in an immunoglobulin molecule replace or be added to it.

In another aspect, an immunoglobulin molecule is provided which has a TPO mimetic peptide in exchange for at least one native CDR region. In this aspect, the TPO mimetic peptide may optionally be extended by proline, as described herein. In further particular embodiments the immunoglobulin molecule is an Fab, a ScFv, a variable region of a heavy chain, a light chain or a full IgG molecule.

Das Immunglobulinmolekül kann auch eine Dimerisierungsdomäne aufweisen, um die Immunglobulinmoleküle, die nur eine CDR durch ein Peptid ersetzt haben, zur Dimerisierung zu befähigen und somit Rezeptoren, die zur Aktivierung eine Dimerisierung erfordern, zu aktivieren.

The immunoglobulin molecule can also have a dimerization domain, in order to enable immunoglobulin molecules which have only one CDR replaced with a peptide to dimerize and thus activate receptors that require dimerization for activation a. In bestimmten Ausführungsformen kann das biologisch aktive Peptid ein lineares Peptidepitop oder ein diskontinuierliches Peptidepitop sein.

In certain embodiments, the bioactive peptide may be a linear peptide epitope or a discontinuous peptide epitope. Die flankierenden Aminosäurereste sind in dem aktiven Peptid nicht typischerweise vorhanden. The flanking amino acid residues are not typically present in the active peptide. Wenn bevorzugte flankierende Aminosäurereste bereits bekannt sind, werden die flankierenden Aminosäurereste von Kodons codiert, welche diese speziellen Aminosäurereste bestimmen.

If preferred flanking amino acid residues are already known, the flanking amino acid residues of codons are encoded that determine these specific amino acid residues. However, a collection of peptides is generated by initial use of codons, such as NNK, NNY, NNR, NNS and the like, which designate a variety of amino acid residues which differ from one another merely by the flanking residues.

Diese zufällige Ansammlung von flankierenden Aminosäuren erlaubt die Selektion der besten Umgebung für eine Präsentation der Peptidsequenz innerhalb des Antikörpergerüsts, das zu spezifischer Bindung an das Zielmolekül und das Ausüben optimaler biologischer Aktivität führt. This random collection of flanking amino acids allows for the selection of the best environment for a presentation of the peptide sequence within the antibody framework that results in specific binding to the target molecule and applying optimal biological activity.

Eine Durchmusterung von Bibliotheken von Immunglobulinen mit einem gemeinsamen Peptid, aber verschiedenen flankierenden Aminosäureresten kann unter Verwendung von Bindungs-, Wachstums- und Aktivierungstests durchgeführt werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind und die hierin beschrieben werden.

A screening of libraries of immunoglobulins having a common peptide but different flanking amino acid residues can be carried out using binding, growth and activation assays, which are known to those skilled in the art and are described herein.

Therefore, the present disclosure provides in one aspect an agonist antibody comprising an antibody framework, which is so constructed that there is at least a biologically active peptide which is a thrombopoietin TPO mimetic, at or in place of at least a portion of one contains or more CDR.

Das biologisch aktive Peptid weist vor dem Einfügen in das Antikörpergerüst Agonistenaktivität auf. The biologically active peptide exhibits agonist activity prior to insertion into the antibody framework. In certain embodiments the antibody framework is constructed so that it contains two peptides that are able to dimerize with each other.

In yet another aspect, the present disclosure is an immunoglobulin molecule comprising a region where amino acid residues corresponding to at least a portion of a complementarity determining region CDR are replaced with a biologically active peptide which is a TPO mimetic wherein the immunoglobulin molecule agonist activity.

In besonders nützlichen Ausführungsformen weist das Immunglobulinmolekül c-mpl-Agonistenaktivität auf. In particularly useful embodiments the immunoglobulin molecule c-mpl agonist activity. Für TPO-Agonisten-Mimetikum-Peptide sind andere Sequenzen möglich, die man unter Verwendung von Bindungs-, Wachstums- und Aktivierungstests auffinden kann, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind und wie sie hierin beschrieben werden.

For TPO agonist mimetic peptides, other sequences are possible, which can locate using binding, growth and activation assays, which are known to those skilled in the art and as described herein. Daher gibt es unter bestimmten Ausführungsformen, die hierin bereitgestellt werden, Immunglobulinmoleküle IgG oder Fragmente z.

Therefore, there are in certain embodiments which are provided herein, immunoglobulin molecules IgG or fragments eg.

Each immunoglobulin molecule antibody or fragment thereof could potentially provide a scaffold and against a peptide according to the present disclosure replaced CDR aufwei sen. For therapeutic use or a diagnostic use in vivo, it is preferred that the antibody is humanized or human origin, such as an anti-tetanus toxoid immunoglobulin. It is contemplated that randomization are subjected after construction of biologically active recombinant antibodies such recombinants which are known in the art to introduce mutations to alter the biological activity of the antibody at one or more points in the sequence.

Nach der Erzeugung von solchen Mutanten unter Verwendung von Randomisierungsverfahren, wie solchen, die hierin beschrieben werden, können die resultierenden Rekombinanten unter Verwendung von Bindungs-, Wachstums-, Expressions- und Aktivierungstests hinsichtlicht Aktivität untersucht werden.

After generation of such mutants using randomization methods such as those described herein, the resulting recombinants using binding, growth, expression and activation assays can respects light activity are investigated. Es werden weiterhin Nukleinsäuremoleküle bereitgestellt, die Immunglobulinmoleküle codieren, bei denen die Aminosäuren von einer oder mehreren CDR-Regionen durch ein biologisch aktives Peptid ersetzt sind.

There are further provided nucleic acid molecules encoding immunoglobulin molecules in which the amino acids are replaced by one or more CDR regions by a biologically active peptide. Diese Nukleinsäuremoleküle können in einem Expressionsvektor vorhanden sein, der für eine Expression dieser Moleküle in eine rekombinante Wirtszelle eingeführt transfiziert werden kann. These nucleic acid molecules can be present in an expression vector, which can be inserted for expression of these molecules in a recombinant host cell transfected.

Methods are also described for producing an immunoglobulin molecule or a fragment thereof containing a biologically active peptide is provided, comprising culturing a recombinant host cell under conditions such that the nucleic acid contained in the cell is expressed. Es werden auch Zusammensetzungen bereitgestellt, die ein Immunglobulinmolekül oder ein Fragment davon, bei dem einer CDR entsprechende Aminosäurereste durch Aminosäurereste, die einem TPO-Mimetikum-Peptid entsprechen, ersetzt sind, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen.

Also provided are compositions comprising an immunoglobulin molecule or a fragment thereof, wherein a CDR corresponding amino acid residues by amino acid residues that correspond to a TPO mimetic-peptide have been replaced, and a pharmaceutically acceptable carrier.

The methods comprise the insertion of a nucleic acid molecule encoding a biologically active peptide which is a TPO mimetic, native place of at least one CDR region of a nucleic acid molecule encoding a heavy or light chain of an immunoglobulin, or adding the molecule to the CDR sequence and then expressing the nucleic acid molecule encoding the variable domain of the heavy or light chain of immunoglobulin, together with its complementary variable region domain, such that the two domains associate with each other.

The methods comprise the insertion of a nucleic acid molecule encoding a biologically active peptide in place of at least a portion of a CDR region of a nucleic acid molecule encoding a heavy or light chain of immunoglobulin, or adding the molecule to the native CDR sequence, and expressing the nucleic acid molecule encoding the variable domain of the heavy or light chain of immunoglobulin, together with its complementary variable region domain, such that the two chains associate with each other.

In another aspect, this disclosure provides a method for producing a binding site in a polypeptide which is capable of binding a pre-selected substance, said method comprising the steps, in which one a nucleotide sequence encoding one of these binding site defining the amino acid residue sequence , in a CDR region of a nucleic acid comprising a gene for the heavy or light chain of immunoglobulin, is introduced by multiplies the CDR region of the immunoglobulin gene, the introduced nucleotide sequence X a b has the formula YX, wherein X is at each occurrence is the same or different and represents a randomized trinucleotide, the sum of a and b is 4 or less and Y is a nucleotide sequence, which is a minimum recognition domain of this binding site.

In noch einem weiteren Aspekt liefert diese Offenbarung Verfahren zur Erzeugung einer Bibliothek von monoklonalen Antikörpern, die hinsichtlich einer gewünschten Aktivität durchmustert werden können. In yet another aspect, this disclosure provides methods for producing a library of monoclonal antibodies that can be screened for a desired activity. Diese Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek umfassen die Stufen, in denen man ein Nukleinsäuremolekül, das ein biologisch aktives Peptid codiert, in eine oder mehrere CDR-Regionen oder anstelle von wenigstens einem Teil von einer oder mehreren CDR-Regionen eines Nukleinsäuremoleküls, das eine schwere oder leichte Kette von Immunglobulin codiert, einfügt, an jeder Seite des eingefügten Nukleinsäuremoleküls bis zu einem Paar von randomisierenden Trinukleotiden bereitstellt und eine Bibliothek von monoklonalen Antikörpern exprimiert.

These methods for producing a library comprising the steps of a nucleic acid molecule encoding a biologically active peptide, in one or more CDR regions, or in place of at least part of one or more CDR regions of a nucleic acid molecule comprising a heavy or encoding immunoglobulin light chain, inserts, providing at each side of the inserted nucleic acid molecule to a pair of randomizing trinucleotides and expressing a library of monoclonal antibodies.

In besonders nützlichen Ausführungsformen wird auf beiden Seiten des eingefügten Nukleinsäuremoleküls ein Paar von randomisierenden Trinukleotiden bereitgestellt. In particularly useful embodiments, a pair of randomizing trinucleotides is provided on both sides of the inserted nucleic acid molecule. Die so hergestellte Bibliothek von monoklonalen Antikörpern kann dann hinsichtlich einer gewünschten Aktivität durchmustert werden. The library of monoclonal antibodies thus produced can then be screened for a desired activity.

In einer speziellen Ausführungsform besitzen Antikörper verschiedene Aminosäuren, die das Peptid an den Amino- und Caboxyltermini flankieren, wo das Peptid an das Antikörpergerüst gebunden wird. In a specific embodiment, antibodies have different amino acids flanking the peptide at the amino and Caboxyltermini where the peptide is bound to the antibody framework. Dies führt zu einer Population von Antikörpermolekülen, die sich in der Präsentation des Peptids unterscheiden können.

This leads to a population of antibody molecules that may differ in the presentation of the peptide. Die Population wird hinsichtlich solcher Antikörper durchmustert, die die biologische Aktivität des Peptids aufweisen. The population is screened for those antibodies that exhibit the biological activity of the peptide. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die unmittelbar an das Peptid angrenzende Aminosäure ein Prolin.

In a preferred embodiment, the amino acid immediately adjacent the peptide is a proline. Wenn die Aktivität des biologisch aktiven Peptides darin besteht, ein Zielmolekül zu aktivieren, kann dies eine Dimerisierung von zwei Zielmolekülen erfordern z.

Rezeptoren in den hämatopoietischen Superfamilien. If the activity of the biologically active peptide is to activate a target molecule, this may be a dimerization of two target molecules require z. Thus, a dimerization takes place, two peptides must be positioned so that each of a target molecule binds so that the two bound target molecules can then be stored together in a suitable manner.

This can be achieved in that two peptides present on the same antibody or in that sought, that two antibody molecules each containing one peptide to bind together. For example, be a single molecule at least a portion of a CDR inserted or replaced with this in and subsequently as an immunoglobulin or an F ab ' 2 fragment to be expressed.

Als ein weiteres Beispiel können zwei Peptide in wenigstens einen Teil von einer oder mehreren CDR eingefügt oder gegen diese ersetzt und als irgendein Antikörper oder Antikörper-Fragment exprimiert werden. As another example, two peptides can be in at least a portion of one or more CDR inserted or replaced with this, and as any antibody or antibody fragment to be expressed.

Die Durchmusterung von Antikörpern kann durch Schwenken mit Zellen, die Oberflächenmoleküle aufweisen, an welche das Peptid spezifisch bindet, durchgeführt werden. The screening of antibodies can be obtained by panning with cells that have surface molecules to which the peptide specifically binds, are performed.

Es kann auch Festphasenbindung unter Verwendung gereinigter Zielmoleküle verwendet werden. It can also be used solid phase binding using purified target molecules. Eine Bindung kann auch in Lösung unter Verwendung markierter Zielmoleküle durchgeführt werden. A binding may also be carried out in solution using labeled target molecules.

Darüber hinaus können Antikörper unter Verwendung biologischer Tests hinsichtlich Agonisten- oder Antagonistenaktivität des Peptides durchmustert werden. In addition, antibodies can be screened for agonist or antagonist activity of the peptide using biological tests.

Es werden auch Bibliotheken von verschiedenen Immunglobulinmolekülen bereitgestellt, in denen Aminosäurereste, die einer Komplementarität bestimmenden Region CDR entsprechen, durch Aminosäurereste ersetzt sind, die ein biologisch aktives Peptid umfassen, welches wenigstens einen zusätzlichen Aminosäurerest an dem Amino- oder dem Carboxyterminus aufweist, und die Immunglobulinmoleküle unterscheiden sich durch den zusätzlichen Aminosäurerest des Peptids.

In specific embodiments the biologically active peptide is a TPO mimetic. Die Antikörper der Bibliothek werden auf einem Phagen präsentiert. The antibodies of the library are displayed on phage. Furthermore, there are provided uses of drugs containing immunoglobulin molecules of the present invention is provided for stimulating proliferation, differentiation or growth of cells which comprises contacting the cells with an effective amount of an immunoglobulin molecule, in which one or more CDR by a biologically active peptide, which is a TPO mimetic are replaced, comprising.

In other specific embodiments, the use of a medicament according to the present invention in stimulating proliferation, differentiation or growth of megakaryocytes by contacting megakaryocytes with an effective amount of an immunoglobulin molecule, in which one or more CDR are replaced with a TPO mimetic peptide , provided. Das Immunglobulinmolekül und die Megakaryozyten können auch in vitro in Kontakt gebracht werden, und die resultierenden Zellen können in den Patienten eingebracht werden.

The immunoglobulin molecule and the megakaryocytes can be brought into contact in vitro, and the resulting cells can be introduced into the patient. Darüber hinaus kann ein Antikörper, der wenigstens ein TPO-Mimetikum-Peptid darin enthalten aufweist, einem Subjekt verabreicht werden, welches beabsichtigt, Blutplättchen zu spenden, wodurch die Kapazität eines Donors zur Erzeugung von Blutplättchen zur Bereitstellung einer robusteren Quelle für solche Blutplättchen erhöht wird.

Moreover, an antibody can be administered to a subject who intends to donate platelets, thus the capacity of a donor to generate platelets to provide a more robust source of such platelets is increased which has contain at least one TPO mimetic peptide therein.

Eine Ausführungsform hierin ist auch ein Verfahren zur Aktivierung eines homodimeren Rezeptorproteins durch Inkontaktbringen des Rezeptors mit einem Immunglobulinmolekül, bei dem eine CDR-Region durch ein biologisch aktives Peptid ersetzt ist, welches den Rezeptor spezifisch bindet und welches dimerisiert wurde. One embodiment herein is also a method of activating a homodimeric receptor protein, by contacting the receptor with an immunoglobulin molecule in which a CDR region replaced with a biologically active peptide that specifically binds the receptor and which has been dimerized.

In einer weiteren Ausführungsform ist der Rezeptor ein Thrombopoietin-Rezeptor. In another embodiment, the receptor is a thrombopoietin receptor. XX repräsentiert die flankierenden zufälligen Aminosäuren.

XX represents flanking random amino acids. The pRL4 was between the Spe I and neighboring Sfi I restriction site modified shown by underlining , so that a flexible linker kappa hinge region of the mouse followed by a Jun leucine zipper dimerization domain, is included. Die Begriffe Immunglobulin und Antikörper werden hierin austauschbar verwendet. As used herein, "immunoglobulin" refers to an entire immunoglobulin molecule or molecules that contain immunologically active portions of whole immunoglobulin molecules and includes Fab, F ab ' 2, scFv, Fv, variable regions of the heavy chain and variable regions of the light chain.

The terms immunoglobulin and antibody are used interchangeably herein. Jedes Peptid, das eine nützliche Eigenschaft aufweist, ist für das Einbringen in ein Antikörpergerüst geeignet. Any peptide having a useful property is suitable for insertion in an antibody framework. Peptidaktivitäten und -verwendungen umfassen Bindung eines Rezeptors, Bindung eines membrangebundenen Oberflächenmoleküls, Bindung eines Liganden, Bindung eines Enzyms oder eines Strukturproteins, Aktivierung oder Hemmung eines Rezeptors, zielgerichtete Arzneimittelauslieferung oder jede enzymatische Aktivität, sind aber darauf nicht beschränkt.

Peptide activities and -verwendungen include binding a receptor, binding a membrane bound surface molecule, binding a ligand, binding an enzyme or structural protein, activating or inhibiting a receptor, targeted drug delivery, or any enzymatic activity, but are not limited thereto.

Es werden üblicherweise diejenigen Peptide ausgewählt, deren Brauchbarkeit aufgrund der erhöhten Stabilität, die ihnen verliehen wird, wenn sie in dem Umfeld eines Immunglobulinmoleküls präsentiert werden, verbessert werden kann.

Are selected typically those peptides whose utility can be due to the increased stability which is imparted to them when they are presented in the context of an immunoglobulin molecule improved. It should be understood that as used herein, "biological activity" includes any activity that is associated with a molecule which activity in a biological system has, including the stimulatory or inhibitory activity by protein-protein interactions as well as the kinetics surrounding such interactions including the stability of a protein-protein complex can be triggered.

It should be understood that a peptide prior to incorporation into the antibody framework may have a biological activity such as, for example, simply binding to a target and a different or enhanced biological activity such as agonist activity after insertion into the antibody framework.

Viele Peptide, die von einer Darbietung in dem Umfeld eines Immunglobulins profitieren könnten, wurden identifiziert und sie sind denjenigen, die auf dem Gebiet tätig sind, bekannt, z. Many peptides which could benefit from a performance in the context of an immunoglobulin have been identified and they are those who are active in the area, known for. R beschrieben ist; Other examples include peptides which bind to receptors which are activated by ligand-induced homodimerization, including active fragments, the G-CSF activity, GHR activity and prolactin activity show how it in Whitty and Borysenko, Chem Biol, R described; April 6 andere Beispiele für geeignete Peptide umfassen ein Nervenwachstumsfaktor-Mimetikum von der CD-Schleife, wie es in Zaccaro et al.

Peptide, die Rezeptorantagonistenaktivität aufweisen, werden ebenfalls in Erwägung gezogen. Peptides which have receptor antagonist activity are also contemplated. Chem, Band , Nr. Chem, vol , no. Peptide können auch unter Verwendung von Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet geläufig sind, entdeckt werden. Peptides can also be discovered using methods which are familiar to those skilled in the art. Um eine Region eines Proteins zu identifizieren, die an einer speziellen biologischen Funktion beteiligt ist, kann eine Prüfung der kürzeren Peptidfragmente, aus denen das Protein aufgebaut ist, das verantwortliche lineare Peptidepitop aufdecken.

To identify a region of a protein that is involved in a specific biological function, a check of the shorter peptide fragments from which the protein is constructed reveal the linear peptide epitope responsible can. Alternativ kann durch Überprüfung von Bibliotheken von zufälligen Peptiden ein Peptid, das ein optimales lineares Epitop oder ein diskontinuierliches Epitop repräsentiert, entdeckt werden, welches die Aktivität des natürlichen Proteins nachahmt.

Alternatively, by examining libraries of random peptides, a peptide that represents an optimal linear epitope or a discontinuous epitope may be discovered that mimics the activity of the natural protein. A method for selection is termed peptide phage display.

In this approach, a random peptide epitope library is generated so that peptides are presented on the surface of a bacteriophage particle.

Diese Sammlungen oder Bibliotheken von Peptiden können dann hinsichtlich solcher, die in der Lage sind, an ein spezifisches immobilisiertes Zielprotein zu binden, überprüft werden Pasqualini, R. These collections, or libraries of peptides can then respect those that are able to bind to a specific immobilized target protein checked Pasqualini, R.

Alternative Peptid-Selektionssysteme sind ebenfalls möglich und umfassen Zelloberflächendarbietung und ribosomale Darbietung. Alternative peptide selection systems are also possible and include cell surface presentation and ribosomal performance.

Peptide mimetics used in accordance with this description generally have a smaller or equal number of amino acid residues that form a CDR region, although they can be longer. Jeder Antikörper kann als eine Gerüstsequenz dienen, jedoch werden typischerweise humane Antikörper ausgewählt, da humane Therapeutika eines der ultimativen Ziele sind. Any antibody can serve as a scaffold sequence, however typically human antibodies are chosen as human therapeutics is one of the ultimate objectives.

In human or humanized antibodies are less likely to cause an adverse immune response in a human patient. A main criterion in selecting an antibody to serve as a scaffold for the introduction of a peptide, is that the replacement must change of one or more CDR of the antibody against the peptide antibody specificity.

The antibody may be a complete antibody or an Fab, scFv or F ab ' 2 fragment, or be part of it. Die resultierende Bibliothek kann dann zur Identifizierung von Antikörper mit einer gewünschten Aktivität durchmustert werden. The resulting library can then be screened to identify antibodies with a desired activity. It should be clear that randomization may be provided in the substituted peptide to generate an antibody library.

USA, 92, , Seiten A suitable antibody is the anti-tetanus toxoid TT Fab, as it is human and because modification of the HCDR3 is sufficient to change the antigen specificity of the antibody Barbas et al.

USA, 92, , pages Beispiele für Verfahren, die zum Einfügen eines gewünschten Peptides mit biologischer Aktivität anstelle einer CDR-Region verwendet werden können, umfassen PCR-Überlappung, Restriktionsenzymstellenklonierung, ortsspezifische Mutagenese und vollständig synthetische Wege, sind darauf aber nicht beschränkt. Examples of methods that can be used to insert a desired peptide having biological activity in place of a CDR region include PCR overlap Restriktionsenzymstellenklonierung, site-specific mutagenesis and completely synthetic routes are, but not limited to.

For a description of techniques involving overlap PCR, see, for example. Ortsspezifische Mutagenese kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden. Site-directed mutagenesis can be accomplished in several ways.

The Muta-Gene in vitro mutagenesis kit is available from BioRad based on this method, and catalog no. Vollständig synthetische Mittel sind ebenfalls gut bekannt und beschrieben, z. Completely synthetic means are also well known and described, for example. Deng et al, Methods Mol Biol Darüber hinaus können die oben genannten Verfahren, die zum Ersatz der gesamten oder eines Teils von wenigstens einer CDR-Sequenz eingesetzt werden, dazu verwendet werden, ein gewünschtes Peptid in wenigstens eine native CDR-Sequenz oder angrenzend dazu einzufügen, ohne die ursprüngliche CDR-Sequenz zu ersetzen.

In addition, the above methods used for replacing all or a portion of at least one CDR sequence can be used to insert a desired peptide into at least one native CDR sequence or adjacent thereto, without the original CDR sequence to replace.

In this manner, a fusion construct of CDR and biologically active peptide mimetic is formed. Flanking sequences can be useful to reduce structural constraints on the attached peptide to allow him that it can take easily a conformation necessary for biological activity. In a preferred embodiment, a flanking region comprising a proline covalently attached to the carboxy terminus of the biologically active peptide to create a proline-extended biologically active peptide.

In einer Ausführungsform kann eine flankierende Region durch Randomisieren von zwei Aminosäurepositionen an jeder Seite der Peptidanfügung erzeugt werden, um die beste Sequenz zu bestimmen.

In one embodiment, a flanking region by randomizing two amino acid positions may be generated at either side of Peptidanfügung to determine the best sequence. Auf diese Art und Weise kann eine Bibliothek erzeugt werden, die Mitglieder mit vielen variierten Sequenzen aufweist. In this way a library can be created, which has members with many varied sequences.

Die resultierenden Konstrukte werden dann hinsichtlich biologischer Aktivität getestet, wie es unten beschrieben wird, z. The resulting constructs are then tested for biological activity, as described below, for example. Es können rekombinante Proteine erzeugt werden, die an speziellen Positionen zufällige Aminosäuren aufweisen.

It can be produced recombinant proteins having random amino acids at specific positions. Dies kann durch Modifizieren der codierenden DNA erreicht werden.

This can be accomplished by modifying the encoding DNA. When introducing at a specific codon position for an amino acid randomization, a preferable deoxyribonucleotide "doping strategy" NNK x in order to cover all 20 amino acids and to minimize the number of encoded stop codons. N can accordingly be A, C, G be or T nominally equimolar , K is G or T nominally equimolar , and x is typically up to about 5, 6, 7, or 8 or more, wherein libraries of mono-, di-, tri-, Quadra, penta-, hexa-, hepta- and octapeptides higher are generated or not.

The third position may also be G or C, which is referred to as "S". Thus, NNK or NNS i encode all of the amino acids, ii only one stop codon, and iii reduce the range of codon-orientation of 6. There are 32 possible codons resulting from the NNK motif: Andere Alternativen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: NNS x, which covers all 20 amino acids and only one stop.

The third nucleotide position in the codon can be performed tailored using any of the known degenerate mixtures. Die Sammlung von hergestellten Antikörpern, die bei diesem Verfahren erzeugt werden, kann hinsichtlich solcher untersucht werden, die Eigenschaften des Peptids aufweisen, z. The collection of produced antibodies, which are produced in this method can be examined with respect to those which exhibit properties of the peptide, eg.

USA, 88, , Seiten , welche hierin durch Bezugnahem aufgenommen sind. USA, 88, , pages , which are incorporated herein by reference up close.

This technology permits recombinant antibodies such as complete antibodies, Fab, F ab ' 2 or scFv expressed on the surface of a filamentous bacteriophage. Dieser gleiche Phage wird die Gene, die den spezifischen Antikörper codieren, in sich tragen. This same phage carrying the genes which encode the specific antibody, in itself. It is contemplated that any other known method of introducing randomization into a sequence may be used herein.

Biol, 3: For example, error-prone PCR can introduce random mutations into nucleic acid sequences see, e. Mol Biol In summary, PCR is run under conditions which compromise the fidelity of replication, whereby random mutations in sequences are introduced, as it would perform in the field of art. Nach der Erzeugung solcher zufälliger Mutanten können diese in Phagen-Display-Formate gebracht, geschwenkt und somit hinsichtlich Aktivität bewertet werden.

After generation of such random mutants, they can be brought into phage display formats, panned and thus evaluated for activity. It is also contemplated that randomization at any point in the nucleotide sequence after receiving an active peptide can be introduced into the antibody to alter the overall biological activity of the antibody.

Auf diese Art und Weise können nicht nur Veränderungen in der biologischen Aktivität eines Peptidmimetikums durch Verursachung von Mutationen innerhalb der Sequenz des Peptids erzeugt werden, sondern es können auch Mutationen in das umgebende Gerüst eingebracht werden, wobei die resultierenden Konstrukte hinsichtlich Veränderungen der biologischen Aktivität oder der Expression untersucht werden. In this way not only changes in the biological activity of a peptide mimetic can be generated by causing mutations within the sequence of the peptide, but it can also be introduced mutations in the surrounding scaffold, wherein the resulting constructs with regard to changes in the biological activity or the expression are examined.

It is in fact contemplated that libraries having repertoires of many constructs resulting from such randomization can be generated and tested. According to the present disclosure, single chain libraries, can be used because an entire binding domain is contained on one polypeptide. Die variable Region der leichten Kette ist von der variablen Region der schweren Kette durch eine Linker-Region getrennt. The variable region of the light chain is separated from the variable region of the heavy chain by a linker region.

Dieser Vektor erlaubt eine Präsentation von chimeren Expressionsprodukten auf der Oberfläche von gepackten Phagemidpartikeln. This vector allows a presentation of chimeric expression products on the surface of packed phagemid.

Monoclonal Antibodies from Combinatorial Libraries. Advances in Immunology Die Ausgestaltung von pRL4 erlaubt eine Dimerisierung von scFv-Antigen-Bindungsdomänen auf der Phagenoberfläche und in löslicher Form, wie es nachfolgend ausführlich beschrieben wird. In this way half of the expressed scFv to the gene III protein as of filamentous phage amino acids fusi oniert, und die andere Hälfte wird unmittelbar bevor das Gen III lösliches scFv produziert, beendet.

In dem fertigen Einzelketttenexpressionskonstrukt in pRL4 sind die Einzelketten-Antikörperfragmente abstromig zu dem E. In the finished Einzelketttenexpressionskonstrukt in pRL4, the single chain antibody fragments are cloned downstream to the E.

These elements allow induction of expression by IPTG, and secretion out of the cell via the omp A leader sequence when expressed in the suppressor strain ER The gIII protein product pill is a smaller envelope protein that is necessary for infectivity. In the periplasmic space, the scFv-gene III fusion proteins are inserted into the membrane.

In case of infection with helper phage, these fragments are exported out of the cell on the surface of phage as pIII-antibody fragments. Other possible proteins that can be used for fusion on the surface of phagemids include filamentous coat protein pVIII and other coat proteins.

Fab fragment libraries, which retain the native antigen recognition site, are useful to ensure that affinity is maintained. In the final hybrid Fab expression construct in pRL4, the light and heavy chains are cloned as a single Sfil fragment.

Auf diese Weise sind die Fragmente der leichten Kette abstromig zu dem E. In this way, the fragments of the light chain are cloned downstream to the E. This element allow induction of expression by IPTG, and secretion out of the cell via the omp A leader sequence.

The fragments of the light chain is followed by a stop codon, a second ribosome binding site, the E. An dem Fusionsübergang ist ein Amber-Stop-Kodon vorhanden. On the merger transition an amber stop codon is present.

In Promotorinduzierung is a single polycistronic message as two polypeptides, a lightweight warp and a heavy chain-gene III fusion protein transcribed and translated.

Nach der Synthese werden die Polypeptide, gesteuert durch die Führungssequenzen, in den bakteriellen periplasmatischen Raum transportiert. After synthesis, polypeptides, controlled by the guide sequences are transported to the bacterial periplasmic space. In dem periplasmatischen Raum werden die Schwere Kette-p III-Fusionsproteine in die Membran eingeführt, und die leichten und schweren Ketten werden durch Disulfidbindungen kovalent miteinander verbunden, wobei die Antigenbindungsstellen ausgebildet werden.

In the periplasmic space the heavy chain p III fusion proteins are inserted into the membrane, and the light and heavy chains are covalently linked by disulfide bonds to each other, wherein the antigen binding sites are formed.

The human constant region CH1 and C L sequences include the cysteines that form the disulfide bonds between heavy and light chains. After superinfection with helper phage, these fragments are exported out of the cell on the surface of phage as Fab-cpIII fusion.

Important features of the pRL4 phage display system used include a purification His 6 tag, an HA epitope tag following the heavy chain, as well as a suppressible amber stop codon between the heavy chain and the phage gene III is arranged. The HA tag is of the HA. The His6 tag allows affinity purification of antibody fragments by Nickel-chelate chromatography Qiagen, Valencia, CA.

The amber stop allows for quick conversion from a fusion Fab-cpIII-product for inclusion in the phage coat when the stop is suppressed, to the soluble Fab which is made in a bacterial host without suppressor.

Selection comprises the isolation of the best candidates that specifically bind to the target molecule of the peptide and show biological activity from the library. The phage expressing on its surface antibody fragments can be produced and concentrated so that it can be opened to all members of a library to bind to the target molecule. Das Zielmolekül kann auf einer Mikrotiterschale, auf ganzen Zellen oder den Membranen von ganzen Zellen immobilisiert sein oder in Lösung vorliegen. The target molecule can be immobilized on a microtiter plate, on whole cells or the membranes of whole cells or in solution.

Unspezifische Ab-Phagen werden weggewaschen, und gebundene Phagenpartikel werden von dem Antigen freigegeben, häufig durch die Anwendung von niedrigem pH-Wert. From non-specific phage are washed away, and bound phage particles are released from the antigen, often through the use of low pH. Die gewonnenen Ab-Phagen sind infektiös und können in einem Bakterienwirt vervielfältigt werden.

The recovered Ab-phage are infectious and can be reproduced in a bacterial host. Typischerweise werden mehrere Runden dieser Art von Selektion durchgeführt. Typically, several rounds of this kind are carried out by selection. Einzelne Antikörperfragmentklone können dann als lösliche Fab oder scFv für eine Identifizierung von solchen, die das Zielmolekül spezifisch erkennen, analysiert werden.

Individual antibody fragment clones can then be analyzed as soluble Fab or scFv for identification of those that specifically recognize the target molecule. Vor jeder Selektionsstrategie werden Ausgangsbibliotheken durch Elektroporation in Wirtszellen, wie beispielsweise ER, eingebracht. Prior to any selection strategy output libraries such as ER, introduced by electroporation into host cells. Überinfektion liefert die verbleibenden Phagenbestandteile, die für eine Verpackung von Plasmiden in Phagemidpartikel erforderlich sind.

Infectious provides the remaining phage components needed for packaging plasmids into phagemid particles of. Alternativ kann Phagen-Display ohne die Verwendung von Helferphagen angewendet werden. Alternatively, phage display can be applied without the use of helper phage.

After overnight growth phagemids are in the culture supernatant with polyethylene glycol PEG precipitated. PEG precipitated phage are used, FACS sorting, or magnetic sorting to purify specific binding antibodies from non-specific binding during pivoting solid phase cell surface, internalization and membrane.

Bei zellgestützten Schwenken werden Antikörper-Phagen-Bibliotheken mit Zielzellen inkubiert, und die nicht anhaftenden Phagen werden mit mehreren Waschschritten entfernt: Ein typisches Schwenkprotokoll ist das folgende: In cell based panning antibody-phage libraries are incubated with target cells, and the non-adherent phage are removed with multiple washes: A typical pivot protocol is the following: Im allgemeinen werden 3 bis 4 Runden des Schwenkens mit jeder Bibliothek durchgeführt.

Generally 3 to 4 rounds of panning are performed on each library. After the last round of panning, the antibody-phage can be removed as single colonies from agar plates, are grown as monoclonal antibody-phage and screened by ELISA for identification of specific binding. FACS-Analyse kann ebenfalls eingesetzt werden.

FACS analysis may also be used. Single colonies are removed from agar plates, grown and induced with IPTG. Die Durchmusterung kann gegen lebende Zellen, gegen intakte, schwach fixierte Zielzellen oder rekombinante s Protein e durchgeführt werden. The screening can be done against live cells, against intact, weakly fixed target cells, or recombinant s protein s. Other techniques for selection which can be used include flow cytometry FACS.

Alternative Methoden für die Selektion unter Verwendung von Bibliotheken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Ribosomen-Display und Plaque-Hybridisierung an ein markiertes Antigen. Nach dem Schwenken zur Isolierung von hochaffinen Antikörper-Bindemolekülen, können biologische Tests hinsichtlich funktionaler Raster von Agonisten-Antikörpern durchgeführt werden. After panning to isolate high affinity antibody binding molecules, biological assays may be performed in terms of functional grid of agonist antibodies.

Dimerisierung ist häufig eine Voraussetzung für eine Aktivierung von vielen Rezeptoren und daher richten sich biologische Tests auf Agonisten-Antikörper, die Rezeptoren über eine Förderung von Dimerisierung stimulieren. Dimerization is often a prerequisite for activation of many receptors and therefore biological tests depend on agonist antibodies that stimulate receptors via promotion of dimerization.

Wie zuvor beschrieben wird bei der Linker-Ausgestaltung eine Einzelketten-Multivalenz angestrebt. Einer Fab-Fragment-Multivalenz kann man sich auf viele Weisen annähern. A Fab fragment Multivalence can be approached in many ways. A number of recent reports in the literature have shown success in the formation of dimeric antibody fragment, which is applicable to the phage display DeKruif, J.

Divalente Fab können auf wenigstens zwei Wegen erzeugt werden. Divalent Fab can be produced in at least two ways. There are a number of dimerization domains iExa, Zn-fingers, fos, jun etc. Dimerisierungsdomänen werden unter den folgenden ausgewählt, sind aber darauf nicht beschränkt: Dimerization domains are selected from the following, but are not limited to: These are functional domains that when incorporated into a molecule allow for dimerization takes place.

Darüber hinaus kann eine Dimerisierung in Zellen durch die Verwendung von Vektoren mit vollständigem IgG oder Dimerisierungsdomänen, wie beispielsweise CH3-Dimerisierungsdomänen, erreicht werden. In addition, dimerization can be achieved in cells through the use of vectors with complete IgG or dimerization domains such as CH3 dimerization domains.

Die Fachleute auf dem Gebiet sind mit diesen und anderen Dimerisierungsdomänen und deren Verwendung zur Dimerisierung vom Proteinen vertraut. Those skilled in the art are familiar with these and other dimerization domains and their use for dimerization of proteins.

Zusätzliche Verfahren, die zur Erzeugung von Antikörperkonstrukten, welche wenigstens zwei Bindungsstellen enthalten, verwendet werden können, sind bekannt. Additional methods that can be used to generate antibody constructs which contain at least two binding sites are known. Der durch jeden dieser Ansätze erzeugte Antikörper könnte zum Testen agonistischer Antikörperaktivität verwendet werden, wie es unten in Beispiel 1 für Gesamt-IgG, das in Säugerzellen hergestellt wird, beschrieben ist.

The antibody produced by each of these approaches could be utilized for testing agonistic antibody activity as described in Example 1 below for whole IgG produced in mammalian cells. These methods include chemical dimerization of Fab, pegylation of Fab, production of Fab'2, generation of whole IgG in bacterial cells, and use of diabodies scFvs.

It is important that each of the antibody forms generated for analysis of agonistic activity could be used as the final therapeutic product. Chemische Dimerisierung kann auch unter Verwendung einer Vielzahl chemischer Vernetzungsreagenzien erreicht werden.

Chemical dimerization can be achieved using a variety of chemical crosslinking reagents. Sth Dieses Reagenz wird primäre Aminogruppen in dem Antikörper modifizieren. This reagent will modify primary amino groups in the antibody. Molecular Probes, Katalog Nr. T] behandelt wurde, hinzugefügt werden.

This maleimide derivatized Fab can be either a second Fab or a separate batch of the same Fab that to reduce the thiol groups to SH with TCEP [ Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride. Molecular Probes, Catalog No. T ] was treated, are added. Die Reduktionsreaktion wird in der Dunkelheit für 15 Minuten durchgeführt. The reduction reaction is carried out in the dark for 15 minutes. The conjugation of the maleimide Fab and the thiol reduced Fab respect takes place in a ratio of 1: Dimers are isolated by passing the reaction over a sephadex gel filtration column.

Für die Dimerisierung können auch andere chemische Linker verwendet werden, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.

For dimerization, other chemical linkers can be used that are known to those skilled in the art. Die Herstellung eines Fab', das einen zusätzlichen Cysteinrest in die Gelenkregion eingebaut hat, wurde beschrieben z.

Patent 5,, and in Carter et al. This Thiolstelle can be used for conjugation to moieties such as polyethylene glycol PEG was used. PE-Gylierungstechnologie ist bekannt, siehe z.

PE Gylierungstechnologie is known. A technology for bacterial production of Fab'2 involves cloning the human IgG hinge region, and optionally part of the CH2, as part of the Fd which includes additional cysteines and is z.

Described , which is incorporated herein by reference. The additional thiol groups on the Fd hinge can interact and cause two Fab 'molecules to dimerize to form an Fab'2. Fab'2 kann direkt aus den Bakterienzellen gereinigt werden. Fab'2 can be purified directly from the bacterial cells. Zusätzlich kann nicht-dimerisiertes Fab' aus den Bakterien isoliert und chemisch in Fab'2 umgewandelt werden. In addition, non-dimerized Fab 'from the bacteria can be isolated and chemically converted to Fab'2.

Wie es früher beschrieben wurde, können die variablen Regionen des Antikörpers als eine einzelne Kette kloniert werden, in der die variable leichte VL mit der variablen schweren VH durch eine Linker-Region verbunden ist. As described earlier, the variable regions of the antibody can be cloned as a single chain in which the variable light VL is connected to the variable heavy VH by a linker region.

Wenn diese Linker-Region kurz ist z. If this linker region is short eg. Auf diese Art und Weise werden auf dem Diabody zwei Antigenbindungsstellen präsentiert. In this way two antigen binding sites are presented on the diabody. Following the panning or sorting steps of Fab libraries, we digested the library of molecules tilted with Sac I and Spe I and cloned into pRL8. Subcloning into the pRL8 vector individually or in bulk by FACS sorting or panning allows expression of dimeric soluble binding Fab for analysis in bioassays.

In pRL8 werden die Antikörperfragmente in den periplasmatischen Raum transportiert und bilden dort Dimere. In pRL8 the antibody fragments are transported to the periplasmic space and form dimers. The advantage of this approach is that it permits pivoting of monomeric Fab fragments, Fab are favored with high affinity.

Ein weiterer Ansatz verwendet einen sekundären Antikörper. Another approach uses a secondary antibody. Sobald bindende scFv oder Fab durch Schwenken oder ein anderes Selektionsverfahren identifiziert sind, werden die einzelnen Klone, von denen jeder ein einzigartiges dimerisiertes Antikörperfragment auf der Phagenoberfläche exprimiert, hinsichtlich Proliferation, Differenzierung, Aktivierung oder Überlebenseffekte an Zielzellen getestet.

If you do not use these specific features or services on the Site, then the only information NameBrand collects will be "Non-Personal Information" i.

Non-Personal Information includes information such as the web pages that you have viewed. In order to access certain features and benefits on our Site, you may need to submit "Personally Identifiable Information" i. Personally Identifiable Information can include information such as your name and email address, among other things.

You are responsible for ensuring the accuracy of the Personally Identifiable Information you submit to NameBrand. Inaccurate information may affect your ability to use the Site, the information you receive when using the Site, and our ability to contact you. For example, your email address should be kept current because that is one of the primary means by which we communicate with you. Please note that this Privacy Policy only applies to information that we collect through the Site and does not apply to information that we may collect from you through other means such as by mail or over the phone.

Please understand that by submitting any Personally Identifiable Information to us, you consent and agree that NameBrand may collect, use and disclose such Personally Identifiable Information in accordance with this Privacy Policy and our Terms of Use, and as permitted or required by law.

If you do not agree with these terms, then please do not provide any Personally Identifiable Information to us. If you refuse or withdraw your consent, or if you choose not to provide us with any required Personally Identifiable Information, NameBrand may not be able to provide you with the services and courses that can be offered on our Site.

When users come to our Site, NameBrand may track, collect and aggregate Non-Personal Information indicating, among other things, which pages of our Site were visited, the order in which they were visited, when they were visited, and which hyperlinks were "clicked. Collecting such information may involve logging the IP address, operating system and browser software used by each user of the Site.

Although such information is not Personally Identifiable Information, we may be able to determine from an IP address a user's Internet Service Provider and the geographic location of his or her point of connectivity. Essentially, cookies are a user's identification card for the NameBrand servers. Web beacons are small graphic files linked to our servers that allow us to track your use of our Site and related functionalities.

Cookies and web beacons allow NameBrand to serve you better and more efficiently, and to personalize your experience at our Site. Cookies and web beacons are not used to retain Personally Identifiable Information.

From time to time NameBrand may also use additional methods of collecting data. NameBrand does not provide any data collected through cookies to third parties. You should be able to control how and whether cookies will be accepted by your web browser. Most browsers offer instructions, in the "Help" section of the toolbar, on how to reset the browser to reject cookies. If you reject our cookies, many functions and conveniences of this Site may not work properly.

Such information may include but is not limited to: In order to subscribe to services, you may be required to provide us with Personally Identifiable Information such as your user name, name, postal address, and email address. You may also be asked to provide demographic information such as date of birth, gender and educational and vocational information. NameBrand may also receive Personally Identifiable Information when you access or log-in to a third party site, e.

Personally Identifiable Information shall not include any information posted or sent by or to you via any public forum. We may permit a limited number of authorized third parties, such as analytics partners, to place cookies through the Site to provide us with better insights into the use of the Site or user demographics. These third parties may collect information, including non-personal information, about a consumer's online activities over time and across different websites when he or she uses our website.

NameBrand takes reasonable measures to protect your Personally Identifiable Information from disclosure to or access by third parties. Please note that NameBrand does not guarantee the security of Personally Identifiable Information, and there is some risk that an unauthorized third party may find a way to circumvent our security systems or that transmission of your information over the Internet will be intercepted.

Any information that you post on our site or send to us in an email is not secure. You also play a role in protecting your information. Please safeguard your user name and password and do not share them with others. If we receive instructions using your log-in information we will consider that you have authorized the instructions. You agree to notify us immediately of any unauthorized use of your account or any other breach of security.

We reserve the right to refuse service, terminate accounts, or remove or edit content in our sole discretion. For your convenience we may provide links to sites operated by organizations other than NameBrand "Third Party Sites" that we believe may be of interest to you. NameBrand does not endorse and is not responsible for the privacy practices of these Third Party Sites. If you choose to click on a link to one of these Third Party Sites, you should review the privacy policy posted on the other site to understand how that Third Party Site collects and uses your Personally Identifiable Information.

This statement explains how we use cookies on our website. For information about what types of personal information will be gathered when you visit the website, and how this information will be used, please see our privacy policy.

All of our web pages use "cookies". A cookie is a small file of letters and numbers that we place on your computer or mobile device if you agree.

These cookies allow us to distinguish you from other users of our website, which helps us to provide you with a good experience when you browse our website and enables us to improve our website. Most web browsers allow some control of most cookies through the browser settings. To find out more about cookies, including how to see what cookies have been set and how to manage and delete them please visit The list below identify the cookies we use and explain the purposes for which they are used.

We may update the information contained in this section from time to time.